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从克隆的但是表型各异的MC3T3-E1细胞系中分离出一系列亚克隆。 从含抗坏血酸培养基生长的成骨细胞中选择高或低成骨细胞分化、矿化的亚克隆。 MC3T3亚克隆4（ATCC CRL-2593）和MC3T3亚克隆14（ATCC CRL-2594）在抗坏血酸和3到4mM无机磷酸盐中生长表现出高水平的成骨细胞分化。 它们10天后形成一个矿化良好的细胞外基质（ECM）。 MC3T3亚克隆24（ATCC CRL-2595)和MC3T3亚克隆30(ATCC CRL-2596)在抗坏血酸中生长表现出很差的成骨细胞分化。 不形成ECM， 可以作为亚克隆4和14的阴性对照。 矿化的亚克隆选择的表达作为成骨细胞标记的mRNA，及唾液酸糖蛋白(BSP)，骨钙素(OCN)，和甲状旁腺激素/甲状旁腺激素相关蛋白受体的mRNA。 高或者低的分化潜能的亚克隆在培养中生产出相似数量的胶原质，表达可比较的基本水平的mRNA编码Osf2/Cbfa1，一种成骨细胞相关转录因子。 植入免疫缺陷小鼠以后，高分化性的亚克隆形成与骨类似的形成小骨的编织骨，低分化细胞只是产生纤维组织。 这些细胞系是研究体外成骨细胞分化的好模型，尤其是ECM信号。 它们和原代培养颅顶成骨细胞的行为类似。

1） 来源：小鼠 颅顶骨

2） 形态：成纤维细胞，贴壁生长

3） 含量：>1x106  细胞数

4） 规格：T25瓶或者1mL冻存管包装

5)  用途：仅供科研使用。
细胞系培养步骤：

细胞系培养‌的步骤主要包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存。

细胞复苏‌：

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。

将融化的细胞移入离心管中，加入37℃预热的DMEM培养基中（其中胎牛血清约为10%），轻轻吹匀，离心，500g离心2min，弃上清液。加入DMEM培养基清洗，弃上清液。加入DMEM培养基，轻轻吹打混匀，制成细胞悬液，接种于培养皿/瓶中，在含5% CO2的细胞培养箱中培养。

细胞传代‌：

当细胞密度达到80%~90%时，去掉培养基，用1X PBS清洗2次。

加入进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。

加入适量DME培养基终止消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM培养基清洗，弃上清液。加入DMEM培养基，轻轻吹打混匀，吸取10微升进行计数，然后按照所需细胞量在含5% CO2的细胞培养箱继续培养。

‌细胞冻存‌：

当细胞密度达到80%~90%时，去掉培养基，用1X PBS清洗2次。

加入行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。

加入DMEM培养基终止消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM培养基清洗，弃上清液。

这些步骤确保了细胞的生长和繁殖能够在体外环境中得到有效的维持和扩展，为科学研究提供了大量的细胞样本‌。

‌细胞系培养‌的步骤主要包括细胞复苏、细胞传代和细胞冻存。

细胞复苏‌：

将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。

将融化的细胞移入离心管中，加入37℃预热的DMEM培养基中（其中胎牛血清约为10%），轻轻吹匀，离心，500g离心2min，弃上清液。加入DMEM培养基清洗，弃上清液。加入DMEM培养基，轻轻吹打混匀，制成细胞悬液，接种于培养皿/瓶中，在含5% CO2的细胞培养箱中培养。

细胞传代‌：

当细胞密度达到80%~90%时，去掉培养基，用1X PBS清洗2次。

加入进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。

加入适量DMEM培养基终止消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM培养基清洗，弃上清液。加入DMEM培养基，轻轻吹打混匀，吸取10微升进行计数，然后按照所需细胞量在含5% CO2的细胞培养箱继续培养。

细胞冻存‌：

当细胞密度达到80%~90%时，去掉培养基，用1X PBS清洗2次。

加入进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。

加入DMEM培养基终止消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM培养基清洗，弃上清液。

这些步骤确保了细胞的生长和繁殖能够在体外环境中得到有效的维持和扩展，为科学研究提供了大量的细胞样本‌

细胞接收后的处理：

1）MC3T3-E1Subclone14小鼠颅顶前骨亚克隆14收到细胞后，75%酒精瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置约2-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。

2）请在4或5X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20×）各2-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据

3）贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放置2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若在60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）,加入新配制的培养基6-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达70%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。

4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完培养基来培养细胞。  收到细胞后次传代建议T25培养瓶1：2传代 。                      

一．培养基及培养冻存条件准备：

1） 准备MEM培养基；胎牛血清，10%；双抗，1%。

2） 培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3） 冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

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