本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA），专用于定量检测猪血清、血浆、组织匀浆及细胞上清液中的高铁血红蛋白（MHB）浓度。检测范围覆盖 0.313-20 ng/mL，灵敏度达 0.16 ng/mL，适用于氧化应激、血红蛋白功能及血液毒性研究等领域。

核心原理：

‌固相化‌：微孔板预先包被抗猪 MHB 抗体。

‌结合‌：加入标准品或样本，MHB 被固相抗体特异性捕获。

‌检测‌：加入标记的抗猪 MHB 抗体和 HRP 标记的亲和素，形成 "抗体 - 抗原 - 酶标抗体" 复合物。

‌显色‌：加入 TMB 底物，被 HRP 催化后由蓝色变为黄色。

‌测定‌：用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度 (OD 值)，浓度与 OD 值成正比。

样本要求：

1. 样本类型与处理

‌血清‌：使用无热原/内毒素试管采集，避免溶血或脂血。1000×g离心10分钟分离血清，-20℃保存，避免反复冻融。

‌血浆‌：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝，离心后取上清。

‌细胞上清‌：1000×g离心10分钟去除颗粒，-70℃保存。

‌组织匀浆‌：生理盐水匀浆后离心取上清，-20℃保存。

2. 注意事项

样本中禁止添加NaN3，以免抑制HRP活性。

细胞培养上清可能因细胞状态等因素导致检测波动，建议设复孔。

操作步骤：

1. 试剂准备

将试剂盒平衡至室温（20-25℃），洗涤缓冲液按1:19稀释。‌

标准品梯度稀释：取6管标准品，按说明书稀释至0.156-10 ng/mL。

2. 实验流程

‌加样‌：每孔加入100μL标准品或样本，37℃孵育90分钟。

‌洗涤‌：弃去液体，每孔加满洗涤液，静置30秒后甩干，重复5次。

‌加检测抗体‌：每孔加入100μL检测抗体-HRP，37℃孵育60分钟。

‌洗涤‌：

‌显色‌：每孔加入90μL TMB底物A+B混合液，37℃避光孵育15分钟。

‌终止‌：每孔加入50μL终止液，立即摇匀（颜色由蓝变黄）。‌

‌检测‌：450nm波长测定吸光度（OD值），15分钟内完成。

关键提示

显色底物避光保存，混合后应为无色。

终止液加入顺序需与显色一致，充分混匀避免绿色残留。

使用封板膜防止蒸发，确保孵育温度稳定。

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