本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA），专用于定量检测大鼠下丘脑、垂体、脑脊液、血清中的 CRF 浓度。检测范围覆盖 0.313-20 ng/mL，灵敏度达 0.16 ng/mL，适用于应激轴激活、焦虑抑郁、肾上腺功能及神经内分泌调节研究。

核心原理：

固相化：微孔板预先包被抗大鼠 CRF 抗体。

结合：加入标准品或样本，CRF 被固相抗体捕获。

检测：加入化的抗大鼠 CRF 抗体和 HRP 标记亲和素，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物。

显色：加入 TMB 底物，被 HRP 催化由蓝色变为黄色。

测定：用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度 (OD 值)，浓度与 OD 值成正比。

样本要求：

1. 样本处理

1) 血清：无菌无热源采集，避免溶血 / 脂血；1000×g 离心 10 min 取上清，-20℃分装，禁反复冻融。

2) 血浆：EDTA / 柠檬酸盐抗凝（慎用肝素），离心分离上清。

3) 细胞上清：1000×g 离心除碎片，-70~-80℃保存。

4) 组织匀浆：预冷 PBS / 生理盐水冰上匀浆，高速离心取清亮上清低温保存。

2. 通用注意

严禁加NaN3抑制 HRP 活性；杜绝溶血、浑浊、污染样本；全程低温防降解；超标样本用试剂盒专用稀释液稀释，实验建议设置复孔。

操作步骤：

1.加样孵育

每孔精准加入 100μL 对应标准品 / 待测样本，空白孔加等量；贴封板膜密封微孔板，置于 37℃恒温孵育箱，避光孵育 90min，保证抗原抗体充分结合。

2.洗板

轻柔弃去孔内液体，吸水纸上快速拍干；每孔加满洗涤工作液，静置浸泡 30s，甩干拍净；重复洗涤5 次，去除未结合杂质，降低背景值。

3.加酶结合物孵育

除空白孔外，每孔加入 100μL HRP 标记特异性检测抗体；轻微水平晃板混匀，重新封板，37℃避光恒温孵育 60min。

4.二次洗板

重复上述洗板操作 5 次，严格拍干孔内残留液体，杜绝残留洗液造成假阳性、数据偏差。

5.底物显色

避光条件下，每孔加入 90μL TMB 底物显色液，轻柔混匀；37℃避光精准孵育 10~15min，此时液体逐步显现蓝色，显色深浅与待测物含量正相关。

6.反应终止

严格遵循加样顺序，每孔快速加入 50μL 酸性终止液，轻晃微孔板充分混匀，蓝色即刻转为黄色，终止酶促显色反应。

7.上机读数检测

加终止液后15min 内，用酶标仪测定各孔 450nm 波长吸光度（OD 值）；以标准品浓度为横坐标、OD 值为纵坐标绘制标准曲线，拟合方程计算待测样本目标蛋白浓度。

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