本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA），专用于定量检测大鼠下丘脑、垂体、血清中的 CRH 浓度。检测范围覆盖 0.313-20 ng/mL，灵敏度达 0.16 ng/mL，适用于 HPA 轴调控、应激反应、免疫 - 内分泌交互及应激相关疾病研究。

核心原理：

固相化：微孔板预先包被抗大鼠 CRH 抗体。

结合：加入标准品或样本，CRH 被固相抗体捕获。

检测：加入化的抗大鼠 CRH 抗体和 HRP 标记亲和素，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物。

显色：加入 TMB 底物，被 HRP 催化由蓝色变为黄色。

测定：用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度 (OD 值)，浓度与 OD 值成正比。

样本要求：

1. 血清：避免溶血脂血，离心分离，-20℃分装，禁反复冻融。

2. 血浆：EDTA / 柠檬酸盐抗凝，慎用肝素，离心取上清。

3. 细胞上清：离心除杂质，-80℃保存。

4. 组织匀浆：冰上匀浆、高速离心取上清低温储存。

5. 禁忌：勿加叠氮钠抑制 HRP；拒收污染溶血样本，建议复孔检测。

操作步骤：

1. 试剂准备

将试剂盒所有组分平衡至室温（20–25℃，≥30min）；浓缩洗涤液按 1:19 稀释配制工作液。

标准品用标准品稀释液复溶，梯度稀释，配置系列浓度梯度标准溶液，备用。

2. 实验流程

加样：设置空白孔、标准孔、样本孔，每孔加入 100 μL 对应标准品 / 待测样本，封板，37℃恒温孵育 90 min。

洗涤：弃净孔内液体，每孔加满洗涤工作液，静置 30 s，甩干拍净，重复洗涤 5 次。

加酶结合物：每孔加入 100 μL HRP 标记检测抗体，封板混匀，37℃孵育 60 min。

洗涤：重复上述洗涤步骤 5 次，拍干微孔。

显色：每孔避光加入 90 μL TMB 底物显色液，轻柔混匀，37℃避光显色 15 min。

终止：按同等顺序每孔快速加入 50 μL 终止液，轻晃混匀，溶液由蓝转黄。

读数：15 min 内，酶标仪 450 nm 波长测定各孔 OD 值，拟合标准曲线计算样本含量。

3. 关键质控要点

全程孵育使用专用封板膜，防止液体蒸发、交叉污染。

洗涤充分为实验核心，残留洗液易造成背景偏高、假阳性。

TMB 显色液避光储存，现用现加，严禁接触氧化剂。

加终止液顺序需与显色加样一致，避免局部色差、绿色残留。

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