本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA），专用于定量检测大鼠血清、血浆、组织匀浆及细胞上清液中的亲环素 A（CyPA）浓度。检测范围覆盖 0.313-20 ng/mL，灵敏度达 0.16 ng/mL，适用于蛋白折叠、免疫炎症、细胞凋亡及氧化应激损伤研究等领域。

核心原理：

固相化：微孔板预先包被抗大鼠 CyPA 抗体。

结合：加入标准品或样本，CyPA 被固相抗体捕获。

检测：加入化的抗大鼠 CyPA 抗体和 HRP 标记的亲和素，形成 "抗体 - 抗原 - 酶标抗体" 复合物。

显色：加入 TMB 底物，被 HRP 催化由蓝色变为黄色。

测定：用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度 (OD 值)，浓度与 OD 值成正比。

样本要求：

1. 样本类型与处理

‌血清‌：使用无热原/内毒素试管采集，避免溶血或脂血。1000×g离心10分钟分离血清，-20℃保存，避免反复冻融。

‌血浆‌：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝，离心后取上清。

‌细胞上清‌：1000×g离心10分钟去除颗粒，-70℃保存。

‌组织匀浆‌：生理盐水匀浆后离心取上清，-20℃保存。

2. 注意事项

样本中禁止添加NaN3，以免抑制HRP活性。

细胞培养上清可能因细胞状态等因素导致检测波动，建议设复孔。

操作步骤：

1. 试剂准备

将试剂盒所有组分平衡至室温（20–25℃，≥30min）；浓缩洗涤液按 1:19 稀释配制工作液。

标准品用标准品稀释液复溶，梯度稀释，配置系列浓度梯度标准溶液，备用。

2. 实验流程

加样：设置空白孔、标准孔、样本孔，每孔加入 100 μL 对应标准品 / 待测样本，封板，37℃恒温孵育 90 min。

洗涤：弃净孔内液体，每孔加满洗涤工作液，静置 30 s，甩干拍净，重复洗涤 5 次。

加酶结合物：每孔加入 100 μL HRP 标记检测抗体，封板混匀，37℃孵育 60 min。

洗涤：重复上述洗涤步骤 5 次，拍干微孔。

显色：每孔避光加入 90 μL TMB 底物显色液，轻柔混匀，37℃避光显色 15 min。

终止：按同等顺序每孔快速加入 50 μL 终止液，轻晃混匀，溶液由蓝转黄。

读数：15 min 内，酶标仪 450 nm 波长测定各孔 OD 值，拟合标准曲线计算样本含量。

3. 关键质控要点

全程孵育使用专用封板膜，防止液体蒸发、交叉污染。

洗涤充分为实验核心，残留洗液易造成背景偏高、假阳性。

TMB 显色液避光储存，现用现加，严禁接触氧化剂。

加终止液顺序需与显色加样一致，避免局部色差、绿色残留。

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