本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA），专用于定量检测大鼠支气管肺泡灌洗液、肺组织匀浆、血清中的 SP-D 浓度。检测范围覆盖 0.313-20 ng/mL，灵敏度达 0.16 ng/mL，适用于肺上皮损伤、肺部炎症、肺纤维化及急性肺损伤评价研究。

核心原理：

固相化：微孔板预先包被抗大鼠 SP-D 抗体。

结合：加入标准品或样本，SP-D 被固相抗体捕获。

检测：加入化的抗大鼠 SP-D 抗体和 HRP 标记亲和素，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物。

显色：加入 TMB 底物，被 HRP 催化由蓝色变为黄色。

测定：用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度 (OD 值)，浓度与 OD 值成正比。

样本要求：

1. 样本类型与处理

‌血清‌：使用无热原/内毒素试管采集，避免溶血或脂血。1000×g离心10分钟分离血清，-20℃保存，避免反复冻融。

‌血浆‌：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝，离心后取上清。

‌细胞上清‌：1000×g离心10分钟去除颗粒，-70℃保存。

‌组织匀浆‌：生理盐水匀浆后离心取上清，-20℃保存。

2. 注意事项

样本中禁止添加NaN3，以免抑制HRP活性。

细胞培养上清可能因细胞状态等因素导致检测波动，建议设复孔。

操作步骤：

1.试剂准备

将试剂盒平衡至室温（20-25℃），浓缩洗涤液按 1:20 稀释备用。

标准品按说明书进行梯度稀释，配制系列浓度标准曲线溶液。

2.实验流程

加样：设置空白孔、标准孔、待测样品孔，空白孔仅加稀释液，其余孔分别加入标准品或待测样品，37℃孵育。

加酶标抗体：除空白孔外，每孔加入酶标抗体，轻轻混匀，37℃避光孵育。

洗涤：弃去孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后甩干，重复洗涤 4-5 次，最后拍干残留液体。

显色：每孔加入 TMB 显色液，37℃避光孵育，孔内呈现蓝色。

终止：每孔加入终止液，混匀后颜色由蓝色转为黄色。

检测：在 450nm 波长下测定各孔 OD 值，15 分钟内完成读数。

3.关键提示

实验全程严格控温，孵育时使用封板膜避免蒸发。

洗涤需充分，否则易造成高背景、结果偏差。

显色液需避光，终止顺序与加样顺序保持一致，确保充分混匀。

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