本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA），专用于定量检测大鼠血清、血浆、组织匀浆及细胞上清液中的血管内皮生长因子 B（VEGF-B）浓度。检测范围覆盖 0.313-20 ng/mL，灵敏度达 0.16 ng/mL，适用于内皮细胞存活、血管稳态、心肌保护及脂质代谢相关血管研究等领域。

核心原理：

固相化：微孔板预先包被抗大鼠 VEGF-B 抗体。

结合：加入标准品或样本，VEGF-B 被固相抗体捕获。

检测：加入化的抗大鼠 VEGF-B 抗体和 HRP 标记的亲和素，形成 "抗体 - 抗原 - 酶标抗体" 复合物。

显色：加入 TMB 底物，被 HRP 催化由蓝色变为黄色。

测定：用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度 (OD 值)，浓度与 OD 值成正比。

样本要求：

1. 样本类型与处理

血清：无热源无菌采血管采集，杜绝溶血、脂血污染；1000×g 离心 10 min 分离上清，-20℃分装保存，严禁反复冻融。血浆：选用 EDTA / 柠檬酸盐 / 肝素抗凝管采血混匀，离心去除血细胞取上清备用（部分试剂盒慎用肝素）。细胞上清：收集后 1000×g 离心 10 min 去除细胞碎片与杂质，-70~-80℃低温保存。组织匀浆：预冷生理盐水 / PBS 冰上制备匀浆，高速离心取澄清上清，-20℃避光分装贮存。

2. 通用注意事项

1) 样本严禁添加叠氮钠（NaN₃），会抑制 HRP 酶活性，导致显色失效。

2) 所有样本避免室温久置，全程低温操作，防止蛋白降解。

3) 溶血、浑浊、微生物污染样本直接废弃，干扰抗体抗原结合。

4) 细胞上清、低丰度指标样本务必设置复孔，校正实验误差。

5) 检测浓度超标时，仅用试剂盒配套稀释液稀释，匹配基质体系。

操作步骤：

1. 试剂准备

将试剂盒所有组分平衡至室温（20–25℃，≥30min）；浓缩洗涤液按 1:19 稀释配制工作液。

标准品用标准品稀释液复溶，梯度稀释，配置系列浓度梯度标准溶液，备用。

2. 实验流程

加样：设置空白孔、标准孔、样本孔，每孔加入 100 μL 对应标准品 / 待测样本，封板，37℃恒温孵育 90 min。

洗涤：弃净孔内液体，每孔加满洗涤工作液，静置 30 s，甩干拍净，重复洗涤 5 次。

加酶结合物：每孔加入 100 μL HRP 标记检测抗体，封板混匀，37℃孵育 60 min。

洗涤：重复上述洗涤步骤 5 次，拍干微孔。

显色：每孔避光加入 90 μL TMB 底物显色液，轻柔混匀，37℃避光显色 15 min。

终止：按同等顺序每孔快速加入 50 μL 终止液，轻晃混匀，溶液由蓝转黄。

读数：15 min 内，酶标仪 450 nm 波长测定各孔 OD 值，拟合标准曲线计算样本含量。

3. 关键质控要点

全程孵育使用专用封板膜，防止液体蒸发、交叉污染。

洗涤充分为实验核心，残留洗液易造成背景偏高、假阳性。

TMB 显色液避光储存，现用现加，严禁接触氧化剂。

加终止液顺序需与显色加样一致，避免局部色差、绿色残留。

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