间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于早期中胚层的一类多能干细胞, 在体内具有分布广泛, 体外能够大量扩增和免疫原性低等特点, 是一种细胞治疗的理想种子细胞。自20世纪60年代，Friedenstein等发现在人骨髓长期培养中, 存在一种形态类似成纤维细胞的贴壁生长的细胞且移植到小鼠体内具有成骨能力和造血支持作用, 将这种细胞命名为骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells, BMSCs)。到20世纪90年代末, 人们才成功分离一种具有成骨、成软骨和成脂肪能力的细胞, 称之为间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)。

      随后研究者也从其他组织, 如脂肪、脐带、胎盘、肝脏、骨实质和肌肉等中成功分离获得间充质干细胞。作为一类成体干细胞中的间充质干细胞, 目前大部分的研究集中在人及大鼠、小鼠这两种模式动物上, 其他动物的间充质干细胞报道相对较少。选取中国*家禽品种鸭子为实验材料, 以鸭胚胎肝脏中的间充质干细胞为研究对象, 对其进行分离培养鉴定, 进行增殖能力检测及分化能力鉴定, 为家禽干细胞研究及畜禽遗传资源保存提供借鉴及参考。鸭胚胎肝间质细胞进行慢病毒转染8-12h，连续传13代，采用高浓度含嘌呤霉素培养基（4μg/mL）培养，筛选阳性克隆；筛选出阳性永生化鸭胚胎肝间质细胞。

鸭胚胎肝间质细胞永生化细胞培养步骤

一．培养基及培养冻存条件准备：

1)准备鸭胚胎肝脏间充质干细胞*培养基（dmem 高糖和F12培养基1：1搭配，10%血清 ，1%双抗以及1％自己配置的间质细胞因子。）。

2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。

3)冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配，液氮储存。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，离心管加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4-5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入T25培养瓶中培养，补加培养基至6ml。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加2ml*培养基终止消化。

3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，加1-2mL培养液后吹匀。

4. 将细胞悬液按1：2到1:5比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中。

3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。