qPCR法检测支原体的具体步骤，核心在于通过特异性引物和荧光探针扩增支原体保守基因序列（如16S rRNA），实现实时荧光监测与快速定性/定量判定，整个流程可在2–3小时内完成，具有高灵敏度和高特异性‌。

一、样本采集与预处理

‌样本类型‌

细胞培养上清、血清、生物制剂、细胞裂解液等；

建议收集‌抗培养7天后的上清液500 μL‌，4℃保存并尽快检测。

‌DNA提取（关键步骤）‌

或采用磁珠法自动化提取，确保去除PCR抑制物，提高检测灵敏度。

提示‌：直接使用未提取的上清液可能导致假阴性，因游离DNA易降解或受基质干扰。

二、试剂准备与反应体系配置

‌试剂选择‌

推荐使用市售qPCR检测试剂盒（如TAKARA CY232、Minerva Biolabs Venor® Gem qEP），含引物、探针、预混液及对照。

三、上机扩增与程序设置

‌仪器选择‌

ABI ViiA7、Roche LightCycler、Bio-Rad CFX等支持多通道荧光检测的qPCR仪。

四、结果判读与数据分析

‌荧光通道解读‌

‌FAM通道‌：检测支原体特异性扩增信号；

‌HEX通道‌：检测内控对照（IC），验证DNA提取与扩增有效性。

‌Ct值判定标准‌

‌Ct < 30‌：强阳性（高浓度支原体污染）；

‌30 ≤ Ct < 40‌：弱阳性（需复测或结合培养法确认）；

‌Ct ≥ 40 或无扩增曲线‌：阴性；

‌HEX无信号‌：提示DNA提取失败或存在PCR抑制物，结果无效。

‌扩增曲线特征‌

阳性样本呈现典型“S"型增长曲线；

阴性对照应无扩增，阳性对照应稳定出峰。

判读口诀‌：FAM有线即为阳，HEX无信要重做，Ct超40算阴性，曲线平直是空白。