制备感受态细胞：

1、从37℃培养16-20h的平板中挑取一个单菌落（直径2-3mm），转到一个含有100mlLB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3h。一般经验，1OD600约含有大肠杆菌DH1×109个/ml。

    为达到转化，活细胞数务必少于108 细胞/ml，对于大多数大肠杆菌来说，这相当于OD600值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20min测定OD600 来监测，用监测的时间及OD600 列一个图表，以便预测培养物OD600值达到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。

    在菌株和菌株之间，OD600值与每毫升活细胞数见的关系变化很大，因此有必要通过测定特异大肠杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并将各稀释浓度的培养物铺于物抗生素的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度计读数得到标准化。

2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min，使培养物冷却至.0℃。

3、于4℃用Sorvall GS3 转头以4100r/min离心10min，以回收细胞。

4、倒出培养液，将管倒置1min以使zui后的痕量培养液流尽。

5、每50ml初始培养液用30ml预冷的0.1mol/L MgCl2-CaCl2溶液(80mmol/L MgCl2，20mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。

6、于4℃用Sorvall GS3 转头以4100r/min离心10min，以回收细胞。

7、倒出培养液，将管导致1min以使zui后的痕量培养液流尽。

8、每50mo初始培养物用2ml用并预冷的0.1mol/L CaCl2（或TFB）重悬每份细胞沉淀。

9、此时，可以按步骤10-16用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于-70℃。

转化：

包括阳性和阴性对照

10、用冷却的无菌吸头从每份用CaCl2溶液制备的感受态悬液中西区200ul转移到无菌离心管（17*100mm）中，每管加入DNA（用不超过10ul的体积，其中的DNA小于50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。

11、将管放入预加热至42℃的循环水浴中，恰恰放置90s，不要摇动管。

热激是一个关键步骤，准确地达到热敷温度非常重要。

12、快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。

13、每管加800ulSOC培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到摇床上，温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

    复苏期中应于37℃温和地摇动细胞（用低于50r/min转速的摇床）。

14、将适当体积（每个90mm平板达200ul）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和相应抗生素的SOB琼脂培养基上。

    如果用四环素作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平米上（或软琼脂中），可以现在微量离心机哈桑室温离心20s以收集转化菌，加100ulSOC重悬沉淀，轻轻混匀。

    重要：玻璃铺菌器需先在乙醇在浸泡，然后在酒精灯上灼烧，待它凉至室温后，才可将转化菌轻轻地铺在琼脂板上。

    如检查氨苄的抗性，用转化菌铺平板时密度应较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37℃培养的时间按不超过20h。氨苄抗性的转化体可将β-内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域的。这样，铺平板时密度过高或培养时间按过长都会导致出血对氨苄敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄而用羧苄，以及将抗生素浓度从60ug/ml提高到100mg/ml,可使情况有所改善，但不能产地*之。抗氨苄的增加与平皿上所加的细菌数的增加并无线形比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞释放生长抑制物质的缘故。

15、将平板置于室温直至液体被吸收。

16、倒置平皿，于37℃培养，12-16h后可出现菌落。