将纯化的西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)制剂免疫BALB/c小鼠,用SP2/0骨髓瘤细胞与经西瓜花叶病毒免疫的BALB/c小鼠的脾细胞融合,有限稀释法克隆和间接ELISA法筛选出1株稳定分泌西瓜花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C6。用间接ELISA方法对所获得的杂交瘤细胞株进行亚型鉴定为IgG1。间接ELISA方法测定腹水效价为1∶105。

    以单克隆抗体为包被抗体、多克隆抗体为检测抗体的TAS-ELISA试剂盒与引自ATCC的西瓜花叶病毒毒源PV-27、PV-379、PV-394、PV-511分离物均有反应,与同属的马铃薯A病毒(Potato virus A)、莴苣花叶病毒(Lettuce mosaicvirus virus)、李痘病毒(Plum pox virus)不发生交叉反应,与同属的番木瓜环斑病毒呈弱阳性反应口蹄疫(Foot and Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的以感染偶蹄动物为主的急性、热性、高度传染性疫病。该病的发生和流行严重危害畜牧业的健康持续发展,造成巨大的经济损失,该病被世界动物卫生组织列为必须通报的多种动物共患传染病之一。细胞

    从2005年起国内不断发生牛口蹄疫,目前面临着Asia 1型口蹄疫的持续危害、O型FMDV的复发感染、新型毒株A型的侵袭风险。因此,国内口蹄疫的防控任务艰巨。我国防控FMD主要采取疫苗免疫和抗体监测为主的综合防控政策,通过接种疫苗提高畜群整体抗体水平来预防口蹄疫的感染和传播。因此牛口蹄疫感染的快速诊断、免疫效果评价、自然感染和疫苗免疫的鉴别诊断成为防控口蹄疫的关键技术。
    本研究通过pPROEXTM HTb表达载体在大肠杆菌DH5α中成功表达了FMDV的vp2基因,获得大小为35ku的融合蛋白,Western blot证实目的蛋白可与FMDV 5种血清型的牛阳性血清发生特异性反应。以此纯化蛋白为抗原建立了牛FMDV VP2蛋白间接ELISA方法。特异性试验表明,该抗原不与常见的7种牛病阳性血清发生交叉反应。检测非免疫无口蹄疫地区牛阴性血清特异性为100%;检测感染血清敏感性为97.3%;与4种商品化试剂盒比较检测O-Asia 1二价灭活苗免疫牛血清364份,符合率分别为69.0%、95.0%、90.4%和86.8%。试验结果表明建立的ELISA方法可用于牛口蹄疫感染和免疫抗体检测。本研究利用实验室融合表达的3B表位串联肽(8BF)为检测抗原建立的间接ELISA为基础,优化组装了一种特异、敏感的间接ELISA试剂盒。
    通过检测大量未免疫、免疫健康牛血清和感染牛血清,确定了判定标准:S/P≥0.3,阳性;0.2≤S/P<0.3,可疑;S/P<0.2,阴性。8BF-ELISA试剂盒检测NSP抗体持续期试验表明,自然感染牛3B表位肽感染后10个月仍为阳性。与3种商品化试剂盒比较检测101份临床样本,和Ceditest? FMDV-NS ELISA、3ABC-I-ELISA符合率高达95%;与3ABC-I-ELISA进一步比较检测528份不同背景的牛血清,总符合率为94.5%(499/528)。大规模检测不同来源的6个牛场共2026份临床牛血清,部分牛群全部阴性,大多数牛群含有阳性牛,阳性率从3%到17%不等,个别感染牛群阳性率高达72.2%。8BF-ELISA试剂盒方便、安全、实用,特异性和敏感性高,用于鉴别诊断牛FMD自然感染和疫苗免疫,为FMD综合防控提供了。细胞