羊A型口蹄疫抗体酶联免疫操作步骤
羊A型口蹄疫抗体(FMDV-A Ab)酶联免疫操作步骤
1.编号:将样品对应微孔按序编号,每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)
2.加样:分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,
3.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
5.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。
6.加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。
7.温育:操作同3。
8.洗涤:操作同5。
9.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色10分钟.
10.终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11.测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
计算和结果判定:
试验有效性:阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10
临界值(CUT OFF)计算:临界值=阴性对照孔平均值+0.15
阴性判定:样品OD值< 临界值(CUT OFF)者为A型口蹄疫抗体(FMDV-A Ab)阴性
阳性判定:样品OD值≥ 临界值(CUT OFF)者为A型口蹄疫抗体(FMDV-A Ab)阳性