本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA），专用于定量检测大鼠血清、血浆、细胞核及组织匀浆中的 NF-κB p65 浓度。检测范围覆盖 0.313-20 ng/mL，灵敏度达 0.16 ng/mL，适用于炎症信号激活、免疫应答、氧化应激及核转录调控研究等领域。

核心原理：

固相化：微孔板预先包被抗大鼠 NF-κB p65 抗体。

结合：加入标准品或样本，p65 被固相抗体捕获。

检测：加入化的抗大鼠 p65 抗体和 HRP 标记的亲和素，形成 "抗体 - 抗原 - 酶标抗体" 复合物。

显色：加入 TMB 底物，被 HRP 催化由蓝色变为黄色。

测定：用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度 (OD 值)，浓度与 OD 值成正比。

样本要求：

1. 样本类型与处理

血清：无热源无菌采血管采集，杜绝溶血、脂血污染；1000×g 离心 10 min 分离上清，-20℃分装保存，严禁反复冻融。血浆：选用 EDTA / 柠檬酸盐 / 肝素抗凝管采血混匀，离心去除血细胞取上清备用（部分试剂盒慎用肝素）。细胞上清：收集后 1000×g 离心 10 min 去除细胞碎片与杂质，-70~-80℃低温保存。组织匀浆：预冷生理盐水 / PBS 冰上制备匀浆，高速离心取澄清上清，-20℃避光分装贮存。

2. 通用注意事项

1) 样本严禁添加叠氮钠（NaN₃），会抑制 HRP 酶活性，导致显色失效。

2) 所有样本避免室温久置，全程低温操作，防止蛋白降解。

3) 溶血、浑浊、微生物污染样本直接废弃，干扰抗体抗原结合。

4) 细胞上清、低丰度指标样本务必设置复孔，校正实验误差。

5) 检测浓度超标时，仅用试剂盒配套稀释液稀释，匹配基质体系。

操作步骤：

1.试剂提前室温平衡 30 min，浓缩洗涤液按说明书稀释配制。

2.设置空白孔、标准品孔、待测样品孔，精准加样后封板。

3.37℃恒温孵育结合反应，结束后弃孔内液体拍干。

4.加满洗涤液浸泡清洗，重复洗板 3–5 次，去除未结合杂质。

5.除空白孔外，每孔加入 HRP 酶结合物，再次 37℃温育。

6.重复洗板流程洗净游离酶标抗体，保证背景干净。

7.依次加入显色液避光显色，待梯度蓝色清晰显现。

8.加入终止液终止反应，颜色由蓝转黄，即刻用酶标仪读取 OD 值。

9.根据标准曲线拟合计算，得出样本目标物质浓度。

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