本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA），专用于定量检测大鼠血清、血浆、组织匀浆及细胞上清液中的细胞周期素 D3 浓度。检测范围覆盖 0.313-20 ng/mL，灵敏度达 0.16 ng/mL，适用于细胞周期 G1/S 期调控、细胞增殖、肿瘤发生及细胞周期紊乱研究等领域。

核心原理：

固相化：微孔板预先包被抗大鼠 Cyclin-D3 抗体。

结合：加入标准品或样本，Cyclin-D3 被固相抗体捕获。

检测：加入化的抗大鼠 Cyclin-D3 抗体和 HRP 标记的亲和素，形成 "抗体 - 抗原 - 酶标抗体" 复合物。

显色：加入 TMB 底物，被 HRP 催化由蓝色变为黄色。

测定：用酶标仪在 450nm 波长测定吸光度 (OD 值)，浓度与 OD 值成正比。

样本要求：

1. 样本类型与处理

血清：无热源无菌采血管采集，杜绝溶血、脂血污染；1000×g 离心 10 min 分离上清，-20℃分装保存，严禁反复冻融。血浆：选用 EDTA / 柠檬酸盐 / 肝素抗凝管采血混匀，离心去除血细胞取上清备用（部分试剂盒慎用肝素）。细胞上清：收集后 1000×g 离心 10 min 去除细胞碎片与杂质，-70~-80℃低温保存。组织匀浆：预冷生理盐水 / PBS 冰上制备匀浆，高速离心取澄清上清，-20℃避光分装贮存。

2. 通用注意事项

1) 样本严禁添加叠氮钠（NaN₃），会抑制 HRP 酶活性，导致显色失效。

2) 所有样本避免室温久置，全程低温操作，防止蛋白降解。

3) 溶血、浑浊、微生物污染样本直接废弃，干扰抗体抗原结合。

4) 细胞上清、低丰度指标样本务必设置复孔，校正实验误差。

5) 检测浓度超标时，仅用试剂盒配套稀释液稀释，匹配基质体系。

操作步骤：

1.试剂准备

将试剂盒平衡至室温（20-25℃），浓缩洗涤液按 1:20 稀释备用。

标准品按说明书进行梯度稀释，配制系列浓度标准曲线溶液。

2.实验流程

加样：设置空白孔、标准孔、待测样品孔，空白孔仅加稀释液，其余孔分别加入标准品或待测样品，37℃孵育。

加酶标抗体：除空白孔外，每孔加入酶标抗体，轻轻混匀，37℃避光孵育。

洗涤：弃去孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后甩干，重复洗涤 4-5 次，最后拍干残留液体。

显色：每孔加入 TMB 显色液，37℃避光孵育，孔内呈现蓝色。

终止：每孔加入终止液，混匀后颜色由蓝色转为黄色。

检测：在 450nm 波长下测定各孔 OD 值，15 分钟内完成读数。

3.关键提示

实验全程严格控温，孵育时使用封板膜避免蒸发。

洗涤需充分，否则易造成高背景、结果偏差。

显色液需避光，终止顺序与加样顺序保持一致，确保充分混匀。

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