大鼠视网膜Müller细胞永生化细胞操作步骤

** 细胞转染与筛选**

完成细胞培养和预处理后，将构建好的SV40大T抗原表达质粒通过脂质体转染法导入原代Müller细胞。转染48小时后，更换为含400μg/mL G418的选择培养基进行抗性筛选，持续2-3周直至未转染细胞死亡。期间需每3天更换一次筛选培养基，并密切观察细胞状态。注意设置未转染细胞作为阴性对照，以确认筛选效果。

**单克隆分离与扩增**

采用有限稀释法进行单克隆分离：将筛选后的细胞悬液稀释至0.5个细胞/100μL，接种于96孔板，每孔加入100μL培养基。培养1周后标记单个细胞形成的克隆，待克隆长至孔底50%面积时，用克隆环法分离并转移至24孔板扩大培养。此过程需特别注意无菌操作，建议每个克隆保留3个备份。

**永生化验证**

通过以下方法验证细胞永生化特性：

1) RT-PCR检测SV40大T抗原mRNA表达；

2) Western blot检测大T抗原蛋白表达；

3) 连续传代观察：永生化细胞应能稳定增殖超过50代，而原代细胞通常在10代左右出现衰老；

4) 生长曲线测定：绘制细胞倍增时间曲线，永生化细胞应保持稳定增殖速率。

** 功能特性鉴定**

为确保永生化细胞保持Müller细胞特性，需进行：

• 免疫荧光染色检测特异性标志物（GS、CRALBP、Vimentin）

• 合成酶活性测定

• 钾离子缓冲功能检测

• 对视网膜神经元条件培养基的反应性测试

**细胞冻存与复苏**

鉴定合格的细胞系按1×10^6细胞/mL密度冻存于含10%DMSO的培养基中，程序降温后转入液氮保存。复苏时采用37℃快速水浴法，离心去除冻存液后重悬于新鲜培养基。建议前3代细胞每代冻存5-10支备份。

**注意事项**

1. 所有操作需在二级生物安全柜中进行

2. 不同批次血清需预先进行细胞生长测试

3. 定期检测支原体污染

4. 建议使用低代次细胞（10-30代）进行实验

5. 原始细胞株应分开保存避免交叉污染