内皮细胞(endothelial cell)在全部血管内面构成单一扁平上皮细胞层，呈多边形，细胞的边缘呈锯齿状，相互嵌合。用酶消化法或机械刮脱法等可将内皮细胞和平滑肌细胞分离，分离的内皮细胞可在培养的条件下生长。

一、原代培养法

(一)灌注消化法

1．材料

(1)标本：兔主动脉。

(2)试剂和药品：PBS、0．05％、培养液、、、0．1％纤维连接蛋白、1．5％明胶。

(3)仪器和材料：手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳、眼科剪、眼科镊、刀片、培养

皿、培养瓶、倒置显微镜、CO2孵箱、恒温振荡器。

2．方法

灌注消化法能够获得纯度较高的内皮细胞，是分离血管内皮细胞的常用方法。

(1)取血管：在无菌条件下取出兔主动脉，用PBS冲洗血管腔，洗去血液。

(2)消化内皮细胞：将血管放入培养皿中，从动脉的一段插入静脉置留针．结扎固定，然后用丝线将另一端结扎。通过静脉置留针向血管内注入消化液，至血管充盈为止。在37℃条件下，消化10～15min。

(3)洗涤细胞：在血管的游离端切口，收集消化液，然后用10ml培养液冲洗管腔。将消化液和冲洗液离心(1000r／min,10min)。吸去上清液，用培养液混悬细胞制成细胞悬液。

(4)包被培养容器：在平皿或培养瓶底部铺纤维连接蛋白，铺匀后静置片刻，吸去剩余液体即可。也可铺明胶，培养过夜，去除多余明胶。

(5)接种细胞：调整细胞悬液浓度为3×105／ml，向25ml培养瓶内接种5ml，或直径10cm的平皿则接种10ml。

(6)培养细胞：置37℃、C02孵箱中培养，每24h换液1次。以后每隔48h换液1次。约6d后细胞可融合成单层内皮细胞。

3．结果观察30min后内皮细胞开始贴壁，细胞呈圆形或多边形。12h后，可见细胞生长繁殖，呈小簇状。24h后，细胞生长形成细胞群。1周后．每个细胞群相互融合形成单量．细胞呈卵石状排列。

4．注意事项向血管腔内注入消化液时，应防止消化液溢出，以免消化血管外膜，引起成纤维细胞的污染。

(二)酶消化法

1.材料

(1)标本：兔主动脉。

(2)试剂和药品：PBS、0．2％胶原酶、培养液、、、O．1％纤维连接蛋白、1．5％明胶。

(3)仪器和材料：手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳、眼科剪、眼科镊、刀片、培养皿、培养瓶、倒置显微镜、c。2孵箱、恒温振荡器。

2．方法

(1)取血管：在无菌条件下取出兔主动脉，放入盛有灭菌PBS的平皿中，剥除血管外的脂肪和纤维组织。

(2)暴露内皮细胞：在盛有PBS的培养皿中，纵向剪开血管壁，然后冲洗。

(3)消化内皮细胞：把血管放至盛有5ml胶原酶的平皿中，使血管内膜面朝下，置37℃、CO2孵箱中消化10～15min，并多次摇动平皿，以使内皮细胞脱落。消化近结束时，可在倒置显微镜下观察。若大部分内皮细胞已脱落，则将消化液移入离心管中。

(4)洗涤细胞：离心(1000r／min，10min)，吸去上清液；再加入5ml PBS悬浮细胞，再离心，吸去上清液。加入5ml培养液悬浮细胞。

(5)包被培养容器、接种细胞和培养细胞同灌注消化法。

3．结果观察培养30min后，内皮细胞贴壁。1周后，细胞生长形成单层，呈卵石状排列。

4．注意事项放入培养皿中的消化液不宜过多，避免消化内皮以外的其他各层组织。

(三)机械刮脱法

1．材料

(1)标本：兔主动脉。

(2)试剂和药品：PBS、培养液、、、O．1％纤维连接蛋白、1．5％明胶。

(3)仪器和材料：手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳、眼科剪、眼科镊、刀片、培养皿、培养瓶、倒置显微镜、C02孵箱、恒温振荡器。

2．方法

(1)取血管：按酶消化法摘取长约20cm的大血管，在无菌条件下纵行剪开。

(2)洗涤血管：用PBS洗净残血，露出血管内皮细胞。将血管固定在标本板上，内皮朝上，再用PBS冲洗2次。

(3)刮取内皮细胞：用刮刀轻轻刮取内膜表面的内皮细胞。刮取时，刮刀与血管表面成60°，轻柔而均匀地推进刮刀。每处只能刮1次，不可刮血管的边缘。

(4)洗涤细胞：刮下的内皮细胞悬浮于培养液中，离心(1000r／min，10min)，吸去上清液；再加入15ml培养液，用滴管轻轻吹打，以便分散细胞团，再离心1次，并吸去上清液。加入5ml培养液悬浮细胞。

(5)包被培养容器、接种细胞和培养细胞同灌注消化法。

3．结果观察30min后内皮细胞开始贴壁，24h后，细胞生长形成细胞群。1周后，细胞呈卵石状排列。

4．注意事项刮内皮时，不要过深和刮至血管断面处，以免引起成纤维细胞污染。